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Revisión Bibliográfica
USO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS CON MOTIVOS CpG COMO INMUNOMODULADORES

AUTORES:

ARIEL ALVAREZ RODRIGUEZ

CECILIA ALCAZAR JOHANNSSEN

RESUMEN

Este es un trabajo de revisión bibliográfica del ADN bacteriano como inmunoestimulador, principalmente el uso de los motivos CpG como adyuvante para vacunas, el tratamiento de los trastornos alérgicos y de tumores. Se revisan los trabajos publicados relacionados con dilucidar el mecanismo de acción molecular de estos compuestos y sus aplicaciones terapéuticas en distintos modelos animales. Se evidencian que los oligonucleótidos con motivos CpG tienen un gran potencial de aplicación en el desarrollo de vacunas y en el tratamiento de trastornos alérgicos. Los ensayos clínicos con seres humanos que recién han comenzada dirán la ultima palabra sobre la incorporación de estos productos al arsenal terapéutico de la medicina moderna.

INTRODUCCIÓN

Desde varios años se observó que las infecciones bacterianas podían inducir remisión de algunos tumores malignos. El potencial “curativo” de bacteria a extractos bacterianos en las enfermedades malignas fue demostrada por el Dr. William Coley quien trató unos 900 pacientes con lisados de bacterias y reportó remisión en un gran número de ellos(1). Estos lisados llegaron a conocerse como la “toxina Coley”. El principio de por qué ocurría esto permaneció en la oscuridad por muchos años pero se sospechaba una estimulación del sistema inmunitario. El componente activador dentro de ese extracto bacteriano era desconocido hasta hace poco tiempo. A principios de la década de 1980, Tokunaga demostró que el ADN bacteriano podía funcionar como el componente inmunoestimulador y antitumoral en el extracto bacteriano y se realizaron ensayos clínicos para evaluar su utilidad en el tratamiento de tumores(2,3). Este ADN era fácilmente degradable y los resultados no fueron muy alentadores ¿Qué contiene el ADN bacteriano que lo hace diferente a nuestro ADN y provoca que sea un potente inmunoestimulador para mamíferos? Esto solo ha sido dilucidado en fecha muy reciente. Krieg y colaboradores(4) demostraron que algunas secuencias de ADN, ricas en CG no metiladas y ubicadas en un contexto de bases determinadas, eran la responsable del potencial inmunoestimulador. Estas secuencias aparecen 20 veces mas frecuentes en el ADN de bacteria que en el ADN de mamíferos y parece constituir una estructura que genera una señal de peligro para el sistema inmunitario. Para corroborar la hipótesis de que la presencia del CG no metiladas dentro de un determinado contexto de bases (motivo CpG) era la estructura molecular que causaba la estimulación de células del sistema inmunitario, se sintetizaron oligonucleótidos con esa secuencia con los que se estimulaba a células de cultivo(4). Estos oligonucleótidos provocaban proliferación y estimulación en células B, macrófagos, células NK y células presentadoras de antígenos. Sin embargo, cuando se metilaba la C se perdía totalmente la capacidad inmunoestimuladora del compuesto. De esta forma, quedó establecido que lo que hace diferente al ADN bacteriano del ADN de mamíferos era la abundancia de motivos CpG en su secuencia. Los oligonucleótidos sintéticos que contienen este motivo de CpG pueden funcionar con fuertes inmunoestimuladores con amplias potencialidades de aplicación.

Este trabajo es una revisión bibliográfica encaminada a conocer y discutir lo que se ha publicado sobre: mecanismos de acción de estos compuestos, su capacidad para actuar como adyuvantes, su potencial en el tratamiento de la alergia y los tumores y sus posibles efectos indeseables. Nuestro objetivo es ofrecer una información, bastante resumida, de lo que se conoce en la actualidad sobre el uso y mecanismos de acción de estos compuestos, así, el lector particularmente interesado por el tema, puede contar con una fuente donde se informa acerca de los avances de este campo y se ofrece una lista bibliográfica bien actualizada y bastante completa sobre el asunto.

MÉTODOS

Buscando en la base de datos de MEDLINE todos los artículos con los términos “CpG and inmun”, seleccionamos los artículos pertinentes que cubrieran los campos mencionados anteriormente. En la mayor parte de ellos solo trabajamos con el resumen.

DESARROLLO

Acción de los oligonucleótidos CpG sobre el sistema inmunitario

Los estudios in vitro han demostrado que los ologanucleótidos con motivos CpG tiene la capacidad de estimular varios tipos celulares entre los que se encuentran linfocitos B, macrófagos, células NK y células dendríticas(5,6). Inducen proliferación y aumentan la producción de anticuerpos en las células B, además, evitan que sufran apoptosis(7). En las células cebadas provocan secreción de factor de necrosis de tumores (TNF) e interleucina 6 sin causar la degranulación (8). Los macrófagos también son estimulados para producir varias linfocinas y activan sus capacidades para matar los microorgansimos fagocitados(8,12). Las células dendríticas sometidas ala acción de los CpG aumentan la expresión de moléculas activadoras(13) y su capacidad de secretar citocinas. Aunque parece que estos oligonucleótidos no estimulan directamente los linfocitos T, si lo hacen indirectamente, a través de las células presentadoras de antígenos. En la figura 1 se muestra un esquema que resume en efecto de los oligonucleótidos CpG sobre las distintas células del sistema inmunitario.

Come se ha planteado, los oligonucleótidos CpG pueden activar los mecanísmos del sistema innato inespecífico así como la respuesta inmunitaria específica, lo que potencia de forma importante la respuesta a un patógeno determinado.

FIGURA 1: Se muestra los efectos que tienen el CpG ADN sobre las distintas células del sistema inmunitario en estudios in vitro. Induce proliferación, secreción de diversas citocinas y expresión de moléculas en la membrana de varias células del sistema inmunitario innato y adquirido.

Un aspecto de gran interés es conocer a través de qué mecanismos moleculares al ADN bacteriano estimula al sistema inmunitario. Todo parece indicar que la estimulación de las células del sistema innato, ocurre de manera muy similar a la que se produce a partir del reconocimiento de los receptores de patrones de patógenos (PRR). Estos receptores están en las membranas de las célulasema inmunitario no específico y reconocen estructuras que están presentes en muchas bacterias como el LPS y algunos patrones de glúcidos(7). Los receptores que se unen a estas estructuras trasmiten señales al interior de la célula hasta provocar la expresión de ciertos genes. Sin embargo, a pesar de todos los esfuerzos, no se ha demostrada que el ADN bacteriano se una a uno de estos receptores. El ADN que se une de forma inespecífica a alguna proteína de la membrana y luego se intruduce al interior de la célula hasta el compartimiento endosómico donde es dirigido por las enzimas lisosomales(1). Se sabe que este paso es esencial para el mecanismo de activación pues los inhibidores de la función lisosomal, como la cloroquina, bloquean la capacidad de estimulación de los CpG(1). Es posible que luego de este paso, el motivo CpG ya procesado, se una de forma específica a alguna proteína intracitoplasmática aún no identificada. Los estudios encaminados en este sentido han demostrado por los PRR TLR-2 y TLR-4 no participan en el preceso pues células y animales en los que se ha anulado el gen que codifíca para estas proteínas mantienen la capacidad de activarse con los oligonucleótidos. Por el contrario el TLR-9 y la proteína intracitoplasmática Myd88 deben formar parte importante de la vía de activación pues su mutación sí bloquea totalmente el proceso de activación(1). Se ha demostrado que el DNA CpG puede activar algunas vías de señales intracelulares. Estas incluyen la generación intracelular de especies reactivas de oxígeno, la activación del regulador de expresión de genes NFkB y de cinasas proteicas activadas por mitógenos. Las vías de señales activadas por el ADN CpG en las células B inducen a estas a secretar IL-6, IL-10 e inmunoglobulinas y a una proliferación policlonal independiente de la activación T(1). Este efecto es sinérgico con la activación que produce en las células B la unión del antígeno a la inmunoglobulina de superficie. Este sinergismo debe propiciar unaactivación preferencial de aquellas células B que estén cerca de patógeno de aquellas que estén mas distante. En la figura 2 se resumen las posibles vías moleculares por las que el ADN CpG puede estimular a las células del sistema inmunitario.

FIGURA 2 Posibles mecanismos moleculares de a acción de los motivos CpG en la activación de las células del sistema inmunitario. El ADN CpG se une a un posible PRR y luego es internalizado al citoplasma, es procesado en los lisosomas y después se unen de forma específica a una proteína aun desconocida. Participa en las vías de activación señalada en la figura.

Posibles aplicaciones clínicas de los oligonucleótidos CpG

El descubrimiento de la capacidad inmunoestimuladora de los oligonucleótidos CpG abre un interesante campo de aplicaciones en medicina. Entre los posibles campos de aplicación consideramos de especial importancia los trastornos alérgicos, las vacunas y defensa ante enfermedades infecciosas y la terapia de tumores malignos metastásicos.

A continuación analizaremos los resultados obtenidos en cada unos de estos campos

Vacunas y enfermedades infecciosas

La vacunación constituye uno de los procederes médicos de mayor impacto en la Salud Pública y una de las vías más eficaces para controlar las enfermedades infecciosas.

Las vacunas modernas están conformadas por dos componentes: el antígeno específico de la enfermedad en cuestión y el adyuvante. Este último es una sustancia que incrementa la respuesta al antígeno. El adyuvante es tan importante que sin él la vacuna sería totalmente ineficaz. Hasta el momento, el único adyuvante de amplio uso en seres humanos es el gel de hidróxido de aluminio que a pesar de ser bastante seguro no es un buen inmunoestimulador. La tendencia en el diseño de nuevas vacunas es utilizar antígenos sintéticos formados por solo algunas proteínas o determinantes antigénicos del patógeno. Esto exige de adyuvantes más potentes. Muchos adyuvantes funcionan al estimular los mecanismos innatos de defensa y, de esta forma, propician una correcta estimulación de los linfocitos. Por la capacidad de estimulación de varias células del sistema inmunitario, los oligonucleótidos con CpG constituyen un interesante inmunoestimulador.

La utilidad de estos compuestos como adyuvantes se ha demostrado tanto en antígenos modelos como en enfermedades infecciosas en particular. Entre los antígenos modelos tenemos a la lisosima, la albúmina y la Beta-galactocidasa (15,18). En estos estudios se ha demostrado que inducen una respuesta de anticuerpos y repuesta celular de tipo Th1,superior al adyuvante completo de Freund y los efectos adversos son mucho menores que este.

Otros estudios para vacunas en determinadas enfermedades infecciosas como la hepatítis B, Toxoide tetánico, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del herpes simple, etc., también han dado resultados muy alentadores. Como dato interesante, tenemos que este adyuvante produce una respuesta con predominio de la vertiente Th1, que se considera un mecanismo protector para muchas enfermedades infecciosas como hepatitis y SIDA. Además ha dado muy buenos resultados en generar una respuesta en las mucosas, atributo no frecuente en los adyuvantes de uso común. A todo esto se une su alta seguridad, principalmente comparada con los adyuvantes más potentes como el de Freund. Los nucleótidos CpG pueden ser administrados junto con la proteína antigénica en una solución acuosa y tal vez más interesante es el hecho que pueden ser incluidos en la secuencia de un plasmodio que se utilice como vacuna de ADN(19). Una vacuna de este tipo ha provocado protección en macacos en un modelo del virus de la inmunodeficiencia humana (20).

Es un estudio donde se comparan con ratones con el antígeno de superficie de la hepatitis B(21) se mostró su superioridad a todos los demás.

La estabilidad de estos compuestos y su fabricación, relativamente barata, los hacen atractivos para que sean usados como adyuvantes en las futuras vacunas.

Aplicación de la CpG en la alergia

Las enfermedades alérgicas constituyen un serio problema de la salud en todo el mundo y principalmente en los países ricos. Una de las hipótesis que tratan de explicar los fenómenos de la alergia es que ocurre un desequilibrio de la respuesta de linfocitos Th a favor de la variante Th2. La producción de linfocitos tipo Th2 como la IL-4, IL-5, IL-&, favorecen la producción de IgE y de todos los mediadores de la alergia. En los últimos años ha ocurrido un notable incremento de la incidencia de trastornos alérgicos en los países del primer mundo y entre las posibles causas se invoca un “exceso de higiene”. Los niños ya no se exponen a la gran cantidad de infecciones bacterianas por el uso de antibióticos potentes y otras medidas higiénicas. Estas infecciones bacterianas de la infancia hacen que se produzca en el organismo una respuesta de tipo Th1, inhibiendo las respuestas Th2, por lo tanto, al ponerse en contacto en los alergenos existe una predisposición para la variante Th1 y una inhibición para el desarrollo de procesos alérgicos. Sin embargo, en los niños que no han sufrido frecuentes infecciones bacterianas hay una predisposición para desencadenar una respuesta tipo Th2 y, por tanto, la alergia. Se ha demostrado que la inmunización con oligonucleótidos CpG favorece una respuesta de tipoTh1 inhibiendo la Th2. Por esta razón ha resultado de gran interés el uso de estos oligonucleótidos en el tratamiento y prevención de alergias.

Hay reportados varios estudios de este tipo en modelos animales y en seres humanos. Estos oligonucleótidos se han conjugado, químicamente, a alergenos derivados del polen y se han utilizado para inmunizar ratones, conejos y monos (22). La inyección de este preparado fue capaz de inducir una potente respuesta Th1 con secreción de interferón gamma y provocó inhibición de la síntesis de IgE. Los investigadores concluyen que este preparado disminuye notablemente la alergenicidad. Las reacciones de anafilaxia constituyen otro gran problema para los alergistas, trabajos en ratones han demostrado que la inmunización con antígenos y oligonucleótidos CpG pueden prevenir las reacciones anafilácticas en estos modelos animales.

Sin dudas la aplicación potencial de estos oligonucleótidos para el tratamiento de los trastornos alérgicos, resulta sumamente promisoria. Hasta el momento, esta aplicación se ha limitado a modelos animales y los resultados han sido muy alentadores (23,25). Es de esperar que en un futuro cercano los ensayos clínicos con seres humanos nos dirán si esta estrategia encuentra lugar en el complejo campo de la terapia de las enfermedades alérgicas.

Aplicación en el tratamiento de tumores malignos

Otro campo de aplicación de estos oligonucleótidos es el tratamiento de tumores malignos. Estos compuestos han demostrado ser efectivos adyuvantes en las “vacunas” contra tumores y pueden inducir protección al reto con tumores letales(1,7). Este efecto adyuvante es sinérgico con el del factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF). Esta citocina produce una respuesta tipo Th2 pero al mezclarla con los oligonucleótidos la respuesta es Th1. Los ensayos clínicos con seres humanos han comenzada recientemente (7)

Efectos adversos indeseables del uso de los CpG ADN

Como todas las drogas, los oligonucleótidos CpG pueden provocar efectos colaterales indeseables. El peligro que más preocupa es su capacidad de producir o activar enfermedades autoinmunes. El tipo de respuesta inmunitaria que media la fisiopatología de estos trastornos es principalmente de tipo Th1. A pesar de que están bien fundados estos temores desde el punto de vista teórico, hasta el momento los estudios realizados no lo han corroborado. En ocasiones han disminuido el desarrollo de Lupus en ratones predispuestos genéticamente (7). Parece ser que las dosis tóxicas son mucho más altas que las dosis terapéuticas (1,7).

CONCLUSIONES

Aunque el CpG ADN puede inducir afectos tóxicos, parece que se requieren dosis mucho más altas que las utilizadas para inducir un efecto terapéutico. Los resultados publicados hasta el momento, indican que es un adyuvante efectivo y bien tolerado para varios antígenos en los cuales se ha ensayado. De gran interés resulta su capacidad para inducir una respuesta tipo Th1 y su potencial de uso para la alergia y el tratamiento de tumores con inmunomoduladores. Aunque los resultados son alentadores, han sido obtenidos en modelos animales. Es necesario la realización de ensayos clínicos con seres humanos para demostrar el potencial de estos compuestos, con el propósito de que pueden sumarse al arsenal terapéutico con que cuenta la medicina moderna.

BIBILIOGRAFÍA

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