Debes activar JavaScripts para ver de forma adecuada esta web.

Página de inicio
Artículo de revisión

ARN interferente: una herramienta y un novedoso mecanismo de regulación génica

Autores
Jorge Jesús Llibre Guerra*
Lorna García Arjona*
*Estudiante de 3er año de medicina

Resumen
El descubrimiento del llamado RNA interferente o RNAi ha posicionado a los RNAs en un papel central en el campo de la Biología en los últimos 7 años. Originalmente las moléculas de RNA se consideraban simples mensajeros encargados de transmitir la información genética del núcleo a los ribosomas, para efectuar la síntesis de proteínas. Actualmente, el descubrimiento reciente de los denominados microRNAs, así como un complejo multiproteico asociado a estos últimos, ha permitido dilucidar nuevos papeles para los RNAs en la represión de la traducción. Una sola de estas moléculas pequeñas de RNA (el miRNA) puede regular la expresión de varios genes simultáneamente, controlando de esta forma, la expresión de cascadas de transducción completas. En el presente trabajo revisaremos los aspectos más relevantes del RNAi. Igualmente especularemos sobre posibles usos de tecnología derivada del RNAi en el campo de la Medicina, como herramientas terapéuticas en el tratamiento de infecciones virales, cáncer y otras patologías.

Palabras claves: RNA interferente, RNAi; RNA de doble cadena, dsRNA; regulación génica; Dicer; silenciamiento de genes; terapia antiviral.

IntroducciÓn
Suele suceder con las revoluciones que sus protagonistas casi nunca son conscientes de ellas. Probablemente ni los colonos que arrojaron el té inglés a las aguas del puerto de Boston en 1773, ni los parisinos que asaltaron la Bastilla pocos años después pensaron que aquello era algo más que un tumulto. Probablemente no sospecharon que estaban cambiando la Historia. Con las revoluciones científicas a veces sucede lo mismo. Es posible que desde hace unos pocos años estemos viviendo una casi sin darnos cuenta. Por eso podría llamarse «silenciosa». Por eso, y también porque se basa en los sistemas de silenciamiento génico o «interferencia por RNA» (RNAi), un recientemente descubierto mecanismo de control de la expresión génica que se ha revelado universal en los eucariotas y que podríamos utilizar con objetivos científicos y terapéuticos.
La historia comenzó hace tan sólo diez años, cuando un grupo de embriólogos del Instituto Carnegie de Washington, estaba estudiando en Caenorhabditis elegans la interferencia que se produce en la expresión génica mediante la introducción de RNA antisentido en las células (1). Desde 1990, y gracias a investigaciones con plantas, se conocía que la unión de moléculas antisentido de DNA o RNA al mRNA bloqueaba su traducción. Lo original del estudio del grupo del Carnegie consistió en introducir en las células RNA de doble cadena (es decir, sentido y antisentido hibridados). La sorpresa debió ser grande cuando comprobaron que el efecto de silenciamiento génico era mucho más potente que con RNA de cadena sencilla, contra lo que cabría esperar (1). Unas pocas moléculas de RNA de doble cadena bastaban para silenciar la expresión génica a pesar de la cantidad mucho mayor de mRNA existente en la célula. Los autores ya apuntaron la existencia de un mecanismo amplificador o catalítico de naturaleza desconocida al que denominaron ARNi, que los hizo merecedores del premio Nobel del 2006 (2).
Justo cuando se cumplen 55 años de la determinación de la estructura de doble hélice del DNA por Watson y Crick (Premios Nobel 1962), el RNA nos enseña que aun tiene mucho que decir sobre la regulación de genes y el control de la expresión de proteínas. Así pues, no sería sorprendente que tras el descubrimiento de los ARNi los próximos 50 años sean dedicados a la compleja maquinaria de regulación dirigida por este último.
Motivados por este nuevo descubrimiento que sin duda alguna iniciara una revolución en la genética hemos decido adentrarnos en este complejo e incierta rama de la ciencia con el objetivo de destacar los aspectos más relevantes del RNAi, sus antecedente y mecanismo de acción. Igualmente especularemos sobre posibles usos de tecnología derivada del RNAi en el campo de la Medicina, como herramientas terapéuticas en el tratamiento de infecciones virales, cáncer y otras afecciones.

Desarrollo
De las petunias al Nobel

Los primeros indicios de la existencia de los ARNi datan de los años 80 cuando un grupo de científicos liderados por el biólogo molecular Rich Jorgensen trabajaban en la obtención de petunias más coloridas (1). La estrategia era relativamente simple, introducían en la planta una copia extra del gen que codifica para la enzima chalcona sintasa, la cual participa en la producción de pigmentos de antocianina, los cuales le proporcionan el color púrpura a las petunias (1). Al sobreexpresar este gen, el grupo de científicos esperaba obtener petunias mucho más púrpuras y de esta forma producir flores con más colorido para la compañía “DNA plant technology” de California, en donde trabajaba este equipo de biólogos moleculares (1).
Sin embargo, el grupo de científicos quedó descorazonado y perplejo del resultado obtenido; todas las plantas transgénicas obtenidas tenían flores blancas, su color natural, cuando no se producen pigmentos de antocianina. Era como si la introducción de una copia extra del gen que codifica para la chalcona sintasa inhibiera al gen endógeno de la planta, resultando en flores blancas.
En el año 1990, el grupo del Dr. Jorgensen publicó estos hallazgos en una revista especializada denominando al fenómeno co-supresión, y dejaron el asunto de la producción de petunias de lado (1). Estas son las primeras evidencias que se recogen del silenciamiento genético producido por los ARN.
Mientras tanto, científicos de la Universidad de Roma trabajando con el hongo Neurospora crassa intentaban sobreproducir el pigmento naranja que sintetiza este hongo, introduciendo copias extra de genes involucrados en la producción de carotenos (compuestos que proporcionan el color naranja a estos hongos) (2). Los resultados obtenidos con este hongo eran, al igual que con las petunias de Jorgensen, descorazonadores. Los hongos transgénicos de Neurospora crassa perdían su color naranja característico por la sobreexpresión de estos genes, resultando en hongos de color blanquecino. Los resultados obtenidos demostraron que el fenómeno de co-supresión no era algo particular de petunias, sino que parecía ser un fenómeno general en eucariontes (2). Este grupo de investigadores denominaron al fenómeno “quelling” (que traducido literalmente del inglés significa supresión). Experimentos realizados por varios grupos habían demostrado para entonces que la supresión era un fenómeno que ocurría a nivel post transcripcional, por lo que se le denominó a este fenómeno Silenciamiento de Genes Postranscripcional o PTGS (del inglés Post Transcriptional Gene Silencing) (2).
El siguiente gran avance en el campo del PTGS vino de un grupo de investigadores que trabajaban con el nemátodo Caenorhabditis elegans donde estaban introduciendo oligonucleótidos antisentido al nemátodo, con el fin de inhibir la expresión de algunos genes involucrados en el desarrollo (3), los resultados de estos experimentos arrojaron que cuando se introducían el oligo sentido y antisentido juntos, la supresión del gen de interés era mucho más eficiente y duradera (3). A pesar de determinar que eran las dos secuencias 8sentido y antisentido juntas), que potenciaban el efecto de supresión, que no pudo ser explicado.
No fue sino hasta 1998 cuando el grupo del Dr. Craig Mello, de la Universidad de Carnegie, demostró que el fenómeno de PTGS era producido por la formación de RNA de doble cadena en el nemátodo. El Dr. Andrew Fire (quien realizaba estudios posdoctorales con Mello) llamó a este fenómeno RNA de interferencia o RNAi, nombre que conserva hasta la fecha (3).
Actualmente sabemos que el fenómeno de PTGS y quelling en plantas y hongos, junto con el fenómeno de RNAi en animales son uno y el mismo (2). Este fenómeno está altamente conservado a lo largo de la evolución, presentándose en organismos tan variados y distantes como levaduras, diversas plantas unicelulares y pluricelulares, hongos, insectos, nemátodos y mamíferos (incluyendo al humano) (3). Sin embargo, es interesante hacer notar que no existen reportes de RNAi en bacterias.

La cascada del silencio
La introducción de ARN de doble hebra (dsARN) proveniente de un virus ARN o artificial, en una célula u organismo, inicia una compleja cascada de eventos, los cuales culminan con la degradación del ARN mensajero (ARNm) de secuencia homóloga al dsARN originalmente introducido (4).
La primera fase de la cascada de eventos está a cargo de una ribonucleasa citoplasmática tipo III (que actúa sobre el ARN de doble cadena) denominada Dicer (4). Esta ribonucleasa fragmenta el dsARN en porciones de 21-25 pares de nucleótidos de longitud, los denominados siARN o ARN interferentes pequeños. Estos siARNs inducen la formación de un complejo de proteínas que se conocen por RISC (del inglés RNA-Induced Silencing Complex) (4). El RISC contiene una helicasa, la cual se encarga de separar las dos hebras del siARN. Durante este paso, el RISC se queda unido a la hebra antisentido del siARN. La que tiene sentido se une a una proteína llamada Argonauta, que la separa del complejo y la entrega al proceso de degradación (5).
Una vez que el RISC se queda con la hebra sencilla antisentido, localiza un ARNm que tiene una secuencia complementaria a esta y se le une. Una proteína del complejo homóloga a Dicer (denominada recientemente Dicer2) con actividad de nucleasa se encarga de cortar el ARNm complementario a la secuencia del siARN (4). Al degradarse el ARNm existente en la célula no se producirá nueva proteína, resultando en la depleción de esa proteína en particular. Esta compleja cascada de eventos se resume en la figura 1.

RNAi, microRNAs y RNAs no codificantes
Aunque el mecanismo expuesto hasta el momento es, sin dudas, deslumbrante, no está conservado por la evolución simplemente para solaz y esparcimiento de los científicos. Debe tener un significado.
En el caso de plantas, es generalmente aceptado que el ARNi representa un mecanismo antiviral de defensa contra patógenos. Muchos virus de plantas tienen genomas de dsARN o producen dsARN intermediarios durante su replicación. Esto activa el mecanismo de ARNi, resultando en el silenciamiento de los genes virales, al tiempo que previene la propagación de la infección en la planta (6).
En animales superiores la situación es distinta, ya que poseemos un sistema inmune eficiente, motivo por el cual no sería muy obvia la necesidad de tener, además de la inmunidad humoral y celular, un sistema de ARNi para combatir infecciones.
El primer descubrimiento en este sentido fue realizado por el grupo del Dr. Víctor Ambros, que buscaba mutantes de C. elegans que tuvieran problemas durante su desarrollo (trabajando en la universidad de Harvard). Ellos estaban interesados en lo que se denomina “interruptores maestros”, que son genes capaces de regular los tiempos de expresión de múltiples proteínas involucradas en la morfogénesis de animales y plantas (6). De esta forma se descubrió el primer microARN.
Al identificar al gen involucrado en este proceso se sorprendieron al descubrir que dicho gen no codificaba para una proteína. El producto de este gen era un ARN de tamaño pequeño, que formaba una estructura de asa imperfecta, parecida a un ganchito de pelo, (shARN por small hairpin) lo que resultaba en una secuencia de dsARN de alrededor de 70 nucleótidos (6).
Actualmente se han reportado alrededor de 400 microARNs presentes, tanto en plantas como en animales, e incluso en humanos. Estos microARNs se encuentran altamente conservados en diferentes especies (7).

Los microARNs se producen en el núcleo de las células y son sintetizados como precursores en el núcleo (denominados microARNs primarios). Luego de un procesamiento nuclear salen al citoplasma a través de los poros nucleares. Los microARNs procesados se denominan inmaduros o pre-microARNs y requieren un procesamiento posterior para generar la forma activa o madura.
Una vez en el citosol de la célula, los pre-microARNs se procesan mediante el corte de la enzima Dicer, la misma enzima que procesa también a los dsARNs en el fenómeno de ARNi, y a partir de este paso, se incorporan al mecanismo que siguen los ARNi (expuesto anteriormente). Se podría decir que los microARNs maduros son el equivalente a siARNs endógenos (8).
El descubrimiento de microRNAs no es trivial. La capacidad de los organismos pluricelulares de producir durante su desarrollo diferentes órganos y células especializadas a tiempos muy específicos requiere la coordinación y control de la expresión de muchos grupos de genes. Los microRNAs son interruptores maestros que coordinan la expresión temporal de muchos genes, que a su vez, pueden controlar otros grupos de genes (8). Esta compleja coordinación espacio-temporal permite el desarrollo del sistema nervioso central, del aparato digestivo, y de las extremidades inferiores o superiores, en animales.

Usos y promesas del RNAi
Aunque la cascada de RNAi es esencial para madurar y regular el efecto de microRNAs, también es cierto que los científicos han tomado ventaja de este poderoso fenómeno con fines experimentales, e incluso terapéuticos.
Recientemente se ha demostrado el poder del uso de dsRNA para silenciar genes importantes para la replicación y morfogénesis de varios virus que afectan a los animales. La introducción de dsRNA homólogos a regiones del genoma del virus de la polio (9), del de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (10) y de la hepatitis C (11), en células humanas, confiere resistencia a la infección por estos virus.
Una gran cantidad de grupos de investigación de todo el mundo se han dedicado a buscar secuencias de dsRNA que puedan servir en el combate de infecciones por muy diversos virus que afectan a humanos y otros animales (12).
Experimentos con animales de granja han permitido valorar el posible uso de dsRNA para contrarrestar infecciones virales que afectan a la industria alimenticia (13). La eficacia del uso de dsRNA y de RNAi como herramientas antivirales podría representar el inicio de una nueva era de terapias antivirales, aunque aún faltan muchas pruebas antes de que el RNAi se utilice como una herramienta en la clínica o en la industria alimenticia. Es necesario determinar, primero, el efecto de la inyección de dsRNA en humanos, con el fin de identificar cualquier posible efecto secundario (9).
En los últimos 10 a 15 años hemos sido testigos de una verdadera explosión del conocimiento en el área de la Genómica y la Biología Molecular. Ya se conoce el mapa completo del genoma de especies como la rata, el ratón, y por supuesto, el humano.
Ahora se nos presenta uno de los retos más grandes que ha enfrentado la Biología Molecular: identificar la función de miles de genes con función desconocida. Esta tarea está lejos de ser simple, por ejemplo, se especula que el genoma humano está formado por alrededor de 30 000 genes de los cuales conocemos la función de menos de la mitad (9).
En este sentido el ARNi nos brinda una posibilidad insuperable, la capacidad de silenciar muchos genes de forma simultánea y rápida, y como el que calla otorga, pues a través de la función perdida puede reconocerse la función del gen.
De esta forma no es descabellado pensar que en un futuro cercano nos demos a la tarea de silenciar genes con funciones desconocidas en ratones y otros organismos. Un trabajo sistemático de este tipo permitiría conocer la función de la mayoría de los genes que forman un genoma complejo (como el del ratón) en tan solo unos años, y de ahí deducir la función de genes homólogos en el humano.
Igualmente interesante será la identificación de enfermedades congénitas debidas a alteraciones en algunos microARNs, como ha sucedido recientemente con el síndrome de retraso mental asociado al cromosoma X frágil y algunos tipos de cáncer (9).
Aunque faltan varias barreras por rebasar, como la vía de administración del dsARN, efectos secundarios en su administración, dosis, contraindicaciones, etc., lo cierto es que experimentos iniciales con ARNi inhibiendo el crecimiento de tumores o infecciones virales han dado resultados muy alentadores como es el caso del SIDA, la Polio, Hepatitis B y C, el virus Sincitial Respiratorio, virus de la Parainfluenza, el Herpes Simplex (virus 2), enfermedades neurológicas como la Esclerosis Lateral Amiotrófica, la Ataxia Espinocerebelosa, la Enfermedad de Hungtington y la Degeneración Macular y enfermedades sistémicas como la Aterosclerosis (9,10,11,13).
La era del ARN apenas se inicia, todavía faltan muchos secretos por descubrir, como la identidad de todos los integrantes del RISC, el mecanismo de propagación de la señal de silenciamiento para las ARN polimerasas dependientes de dsARN, etc, pero se ha iniciado sin duda alguna una revolución silenciosa.

CONCLUSIONES
La búsqueda por mejorar una flor de ornamento nos ha llevado a uno de los descubrimientos más interesantes y relevantes de la Biología Molecular, el ARN de interferencia.
Esta metodología promete facilitarnos el trabajo en la identificación de la función de muchos genes, así como producir una nueva generación de agentes antivirales muy selectivos y eficientes.
Otro uso explorado aún insuficientemente del ARNi reside en la inhibición de oncogenes que se encuentran alterados en células cancerosas, como en el Linfoma y la Leucemia Linfocítica Crónica.
Finalmente, el uso del RNAi como una herramienta en el silenciamiento de genes, seguramente impulsará notablemente nuestro avance en la determinación de la función de los miles de genes sin función conocida, presentes en los genomas de animales de interés en el laboratorio y del mismo hombre.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Tang, G. and P.D. Zamore, Biochemical dissection of RNA silencing in plants. Methods Mol Biol, 2004. 257: 223-244.
2. Fire A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998. 391(6669): 806-811.
3. Kennedy, S., D. Wang, and G. Ruvkun, A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature, 2004. 427(6975): 645-649.
4. Hannon G.J., RNA interference. Nature, 2002. 418(6894): 244-251.
5. Reynolds, A., et al., Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol, 2004. 22(3): 326- 330.
6. Carrington, J.C. and V. Ambros, Role of microRNAs in plant and animal development. Science, 2003. 301(5631): 336-338.
7. Lee, Y.S., et al., Distinct Roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA Silencing Pathways. Cell, 2004. 117(1): 69-81.
8. Hutvagner, G. and P.D. Zamore, A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 2002. 297(5589): 2056-2060.
9. Agrawal N.RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev, 2003. 67(4): 657-685.
10. Jacque J.M., Triques K., Stevenson M., Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature, 2002. 418(6896): 435-438.
11. Kapadia, S.B., A. Brideau-Andersen, and F.V. Chisari, Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(4): 2014-2018.
12. Dector M.A. Rotavirus gene silencing by small interfering RNAs. EMBO Rep, 2002. 3(12): 1175-1180.
13. Wang Q.C., Nie Q.H, Feng Z.H., RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J Gastroenterol, 2003. 9(8): 1657-1661.


Anexos

Figura 1. El Mecanismo de RNAi.
Imagen no visible
Tomado de Bernards j and colgrove d. the ethics and politics of compulsory hpv vaccination. perspective , 2006 355(2392) : Los largos RNAs de doble banda son fragmentados por una nucleasa (Dicer) en pequeños fragmentos de RNA (siRNA; los triángulos anaranjados indican sitios del corte de Dicer). El siRNA también puede ser sintetizado in vitro y puede ser introducido en las células (que produce silenciamiento génico transitorio) o pueden ser producidos en la propia célula como un vector basado en el DNA que codifica short hairpin RNA (shRNA) que permite el silenciamiento génico persistente.(Las flechas rojas indican estos orígenes diferentes de siRNA.) siRNA es incorporado en el complejo proteico RNA-induced silencing complex (RISC), el cual primero separa las dos hebras de siRNA, a continuación elimina una y mantiene la antisentido unida a la que expone al medio ambiente celular, permitiéndole reconocer moléculas del RNA mensajero (mRNA) que contienen una secuencia complementaria perfecta. Una vez que es unida a RISC, la molécula del mRNA son fragmentadas y degradadas. El gen correspondiente es así de silenciado a través de un mecanismo postranscripcional.